Al comenzar un juego nuevo lo primero que tendrás que hacer, es poner un nombre para tus partidas grabadas. Después verás un vídeo de introducción donde una pequeña Katrielle (la hija del legendario profesor Layton) pierde a su padre entre la niebla. Todo es una pesadilla y, al despertar, la joven se prepara para su primer día de trabajo en una nueva agencia de investigación que ella misma ha abierto.
Al terminar el vídeo verás a Katrielle delante de la agencia de detectives, pero antes de entrar un perro se acerca a ella y le habla. Ella no solo no se asombra demasiado por ese asombroso hecho, sino que acepta ayudarle a resolver el primer puzle del juego, puzle número 1.
Después de resolverlo entrarás en la agencia y conocerás al inspector de policía Hastings y también a tu ayudante en la agencia, el joven estudiante Howerd Phanon. En este momento grabarás tu partida por primera vez (puedes elegir cualquiera de los 3 casilleros libres). Recuerda que el juego no graba automáticamente, tendrás que entrar en el menú principal del juego (entrando en el baúl) y grabar tú cuando quieras.
El inspector necesita tu ayuda para resolver un caso, aunque tú ya has aceptado el caso de tu nuevo amigo, el perro hablador. Justo después empezará el caso 01: La hora más dulce.